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Introducción

Para algunos autores no existe una sustancia mas importante que el ADN. Esta idea se basa ppalmente en 3 postulados:

¨       El primero indica que el ADN contiene dentro de su molécula la información que determina la estructura de proteínas generadoras universales de las funciones celulares.

¨       El segundo indica que el ADN tiene la capacidad de transmitir esta información en forma hereditaria.

¨       El tercer postulado indica que esta molécula ha dado la base de todos los procesos evolutivos que han generado los miles de millones diferentes de formas de vida que ocupan la tierra desde la existencia de las primeras formas de vida hace 3 o 4 mil millones de años.

El conjunto de instrucciones genéticas esta ubicado en el llamado genoma: el ADN que codifica estas instrucciones junto con proteínas necesarias para ejercer su función forman los denominados cromosomas.

Todas las formas de vida están constituidas por células, que son compartimientos cerrados por una membrana y llenos de soluciones de elementos de naturaleza química.

El bagaje genético esta organizado en cromosomas, los cuales están compuestos por ADN y proteínas en estructuras fuertemente comprimidas.

Cada cromosoma esta compuesto por miles de genes, las zonas funciones del ADN y por otras zonas no codificantes. Cada gen es la unidad funcional mas pequeña y contiene la información para la síntesis de una proteina.

La función de generar un organismo ha sido asignada a las células germinales. Estas son capaces de reducir el numero de cromosomas a la mitad por una división celular llamada meiosis. Los productos de la meiosis son células haploides llamadas gametas. Estas células presentan una sola copia de los cromosomas autosomicos y uno de los cromosomas sexuales.

Las gametas se combinan para formar una célula única diploide con capacidad para generar 10 billones de células constituyentes del organismo.

La división celular de estas células somáticas mediante los procesos de mitosis aseguran la transmisión de la información genética existente en el ADN.

La unidad de un tejido es la célula, de tal manera que en el mal funcionamiento de las células de un tejido da lugar al mal funcionamiento del órgano al cual pertenece dicho tejido.

Ciclo Celular

Cada célula esta capacitada para duplicar su material genético, mediante la duplicación del ADN, y luego dividirse para formar células hijas. Estas mismas células a su vez tienen la capacidad de generar la formación de proteínas también a partir del ADN. Estos procesos denominados duplicación de ADN o duplicación del material genético y transcripción o generación del intermediario (ARN) para la síntesis de proteínas se realiza en etapas del ciclo denominado Ciclo Celular.

Se denomina ciclo celular al conjunto de etapas que sigue la célula durante su crecimiento y división.

La mayoría de los componentes de una célula se sintetizan durante la Interfase. Este es el periodo entre divisiones y ocupa el 90% del ciclo. La primera parte de la interfase se denomina G₁, proviene de gap que significa interrupción o suspensión de la continuidad (en este caso primera interrupción), le sigue la fase S, en la cual hay síntesis de ADN y G₂ o segunda interrupción. En G₁ hay un crecimiento rápido con una gran actividad metabólica, que incluye síntesis de ARN y de proteínas. El periodo de crecimiento celular continua en la fase S y es aquí cuando se duplica el ADN. En la fase G₂ la célula continua su crecimiento y prepara la célula para su división. La división celular en si misma, o sea, la mitosis se conoce como fase M. Las células que no se dividen por periodos largos de tiempo, no tienen duplicación de ADN y se las considera en periodo de reposo, o sea en periodo G₀. Los oncogenes actúan acelerando la velocidad de crecimiento celular en la fase G₁ y pueden llegar a provocar que la célula proceda a una mitosis en vez de hacia la fase G₀. los genes supresores de tumor pueden actuar como señales de freno en G₁ para frenar o desacelerar el ciclo celular antes de la fase S. A lo largo de todo ciclo celular los genes que codifican para enzimas reparadoras de ADN pueden estar activos, y particularmente lo están en la fase G₂ después de la duplicación de ADN, antes que los cromosomas estén listos para la mitosis.

Esquema del Ciclo Celular

La programación de las células eucariotas a través del ciclo celular esta gobernada por una formación, Activacion y desactivación de un complejo enzimático de proteínas quinasas denominadas ciclinas (cdk).

Las entradas a las diferentes fases o etapas del ciclo celular esta regulada por la Activacion y también por la regulación negativa del complejo cdk. Esta regulación tiene principalmente un fin, que no se prosiga en el ciclo sin haber sido completada la fase correspondiente produciéndose todos los eventos moleculares necesarios. A estos ptos de regulación se los denomina "check points". Dentro de estos, uno de los mas estudiados y documentados es aquel que monitorea la terminación de la síntesis de ADN y la formación del huso funcional actuando en la transición de G₂ a M y en la salida de la mitosis. Por ejemplo, en algunos sistemas cuando el ADN no esta replicado se inhibe la Activacion del complejo cdk por inhibición de la defosforilacion de una proteina quinasas la ciclina b-cdk2. Esta quinasa cuando esta fosforilada en una tirosina en la posición 15 activa el complejo y regula la transición de la fase G₂ a M.

Este mecanismo de regulación negativa requiere la Activacion de varios genes que finalmente dan lugar a la Activacion de una quinasa denominada Wee 1- MlK-1, la cual es la encargada de mantener fosforilada la tirosina.

Existen check points en las etapas tempranas del ciclo celular que controlan la entrada a la fase S.

Todos estos eventos están regulados por la acción de factores de origen proteico actuando a través de sus receptores de membrana. Hay diversos factores que interviene, entre los que se encuentran los factores de crecimiento y las Citoquinas. Podemos definir a los factores de crecimiento como polipéptidos que estimulan o inhiben la proliferación celular, en tanto que las citoquinas son reguladoras de la inflamación y la rta inmune. Ambos actúan a través de receptores de membrana de alta afinidad. Muchos factores de crecimiento también tienen efecto en migración celular, formación de la matriz, diferenciación y apoptosis.

Un numero elevado de factores de crecimiento entre los cuales se encuentran el EFG, factor de crecimiento fibroblastico (FGF), PDGF, factor de crecimiento de macrófagos (CSF) y los factores de crecimiento insulino-símiles estimulan la mitosis celular por interacción con receptores de membrana.

La mayoría de los factores de crecimiento cumplen su función modificando la actividad de enzimas por reacciones de fosfo-desfosforilacion.

El receptor de insulina tiene actividad de tirosina quinasa. O sea que la primera fosforilación en el mecanismo de acción de los factores de crecimiento es la fosforilación en tirosina de enzimas. Esta fosforilación iniciara la cascada de eventos que dan lugar a la regulación del complejo enzimático de las ciclinas.

Los receptores presentan en su constitución proteica un domino extracelular que reconoce a los factores de crecimiento que esta ligado por un dominio orientado de citoplasma a otro dominio que posee el sitio catalítico de la actividad de tirosina quinasa. En esta flia de receptores se pueden distinguir 3 tipos. El receptor tipo I tiene como representante al EGF. En el tipo II están presentados los factores de crecimiento insulino-símiles y en los del grupo III PDGF y los oncogenes c-fms que codificarían proteínas relacionadas a este receptor.

Estos receptores son componentes claves para el control del crecimiento y diferenciación celular por su habilidad de generar señales mitogenicas. A su vez estas señales proporcionan y están encuadradas como llaves para el entendimiento de los procesos de transformación celular. Por ejemplo, un incremento en la expresión de una subclase de receptores para factores de crecimiento con actividad de tirosina quinasa, debido a una amplificación deben la expresión de su gen, da como resultado el crecimiento de células malignas aun en humanos.

El mecanismo exacto por el cual los factores de crecimiento pueden regular el crecimiento y diferenciación celular es motivo de numerosas investigaciones. Dentro de estas hipótesis existe la regulación de la fosforilación de una proteina ribosomal denominada S6 como uno de los probables gatillos para que se produzca la iniciación de la síntesis de ADN.

El/los mecanismo/s de acción de factores de crecimiento/citoquinas en la estimulación de la proliferación celular es muy compleja. La mayoría se une a receptores transmembrana que tienen actividad de tirosina quinasa en algún dominio o se une a una tirosina quinasa Src-símil como Jak o Tyk. Cuando el factor se une al receptor produce una transfosforilacion del receptor en tirosina. Esta tirosina fosforilada sirve de soporte a enzimas citosolicas o moléculas adaptadoras las cuales a su vez se fosforilan en tirosinas y se activan desencadenando mecanismo de señales de transducción para cambios en forma celular, diferenciación o proliferación. Los pasos de proliferación pueden incluir moléculas adaptadoras como Shc o Grb2, las cuales producen un incremento en el GTP unido a Ras, Activacion de Raf y estimulación de la cascada de quinasa de serina-treonina MAP, la cual culmina con la fosforilación de factores de transcripción.

Un mecanismo alternativo incluye la fosforilación de factores de transcripción por receptores e involucra la fosforilación de STAT (transductores de señales y activadores de transcripción). Las proteínas STAT se conoce que una vez fosforiladas migran al núcleo para unirse al factor de transcripción "secuencias activada gamma" (GAS); este mecanismo, muy complejo de señales inicia el ciclo celular muy temprano en la fase G1, para avanzar en la progresión del ciclo celular siendo regulado por las CDKs.

La ausencia de estos factores de crecimiento hace que las células se detengan en la fase temprana de G₁ llamada también G₀. El factor inhibidor del crecimiento denominado TGF beta o "growth inhibition transforming factor" inhibe la entrada de las células a la fase G₁. Este factor trabajando también a través de la Activacion de receptores de membrana genera las señales necesarias para inhibir la Activacion del complejo ciclina o "ciclin complex". Este mecanismo se produce por la inhibición de la expresión de una de las enzimas del complejo denominada cdk4.

Existe otra proteina denominada Cip 1 que inhibe el complejo cyclin-cdk, que es inducida por otra proteina denominada p53 a cuyo gen se lo denomina "gen supresor".

De este modo, la maquinaria para el ciclo celular es un pto de convergencia intracelular de señales de crecimiento en la fase G₁. Una vez iniciada la cascada de señales de transducción por los receptores tirosina quinasa, progresa la acción, controlada ahora por las CDKs.

Estas CDKs están presentes en todo el ciclo celular y su actividad es regulada por ciclinas que las activan y por inhibidores de CDKs. Las ciclinas CDKs e inhibidores de CDKs son responsables de la regulación de la progresión de G₁ a S del ciclo celular.

La ciclina tipo D se expresa en la fase media de G1 y une CDKs; una vez fosforilado este complejo holoenzimatico por CAK (quinasa activadora de CDK) se activa para fosforilar otras proteínas incluyendo Rb. La ciclina D1 es idéntica a los oncogenes bc11 y PRAD1. La ciclina D2 se comprobó su identidad con el oncogen Vin-1. La ciclina E se expresa en la fase G₁ tardía, une CDK2 la cual es activada por CAK y fosforila Rb (Rb es el gen supresor de retinoblastoma).

Los inhibidores de CDK son reguladores importantes de la actividad de CDK2 y CDK4. Otras proteínas (INK4, p16^MTSI/INK4A y p15^MTS2/INK4B) representan genes supresores de tumor que están deleccionados en muchos canceres e inhiben el complejo ciclina D-CDK2. otros inhibidores de CDK tienen una especificidad muy amplia inhibiendo la actividad de ambos complejos de ciclinas: D-CDK4 y E-CDK2; estos son p21^WAF1/CIP1, que se induce por el gen supresor de tumor p53 como rta al daño de ADN, y p27^KIP1. Ha sido demostrado que Rb es un blanco estratégico de señales regulatorias que gobiernan la transición G₁/S en muchos tipos celulares. Cuando Rb se encuentra como proteina no fosforilada en G₁ es activa como supresora de crecimiento y esta actividad esta vinculada a su capacidad de unir proteínas de la familia del factor de transcripción E2F. En la fase G₁ tardía la pRb esta hiperfosforilada y se libera E2F, lo cual activa la transcripción de genes que se requieren para la transición G₁/S, y para la síntesis de ADN. Además de pRb hay otras 2 proteínas pRb-símiles, p107 y p130, recientemente identificadas que también regularían el crecimiento durante la fase G₁ y son blanco de fosforilaciones especificas en el ciclo celular por quinasa dependientes de ciclinas.

Estos reguladores nucleares de la progresión del ciclo celular son potenciales puntos clave para una terapéutica en cáncer. Todos estos puntos de control del ciclo son importantes para el mantenimiento de la integridad genomica. Estos genes integran un sensor de las condiciones del entorno para una adecuada rta ante un daño en el ADN; estos mecanismo están frecuentemente deteriorados en células cancerigenas y se manifiesta como la alta inestabilidad genomica que presentan. Aunque esta inestabilidad genomica no necesariamente significa que se generaran estos eventos malignizantes, sí incrementa mucho la posibilidad de que ocurran , a través de inactivacion de genes supresores y de la Activacion de oncogenes, ya que la malignizacion celular es un proceso de muchos pasos que da lugar a una gran heterogeneidad celular.

Si bien las células mamíferas tienen muchos mecanismo para mantener la integridad genética, cuando se alteran estos pasos en cáncer da lugar a las metástasis y resistencia a las drogas. Estos fenómenos se inician cuando la célula sufre un daño en su ADN ya sea provocado por procesos endogenos o exógenos, lo cual altera su estructura, la progresión del ciclo celular se frena mientras el daño del ADN se repara o la célula es eliminada por apoptosis. En las células en las cuales hay mutaciones que alteran los pasos de detección, reparación o rta al daño de ADN, el ciclo celular no se frena, se producen alteraciones cromosomicas que activan oncogenes o inactivan genes supresores de tumores.

Estructura y Función del ADN

Cada molécula de ADN contiene dos cadenas de nucleótidos, compuestos de un azúcar (desoxirribosa), grupo fosfato y 4 bases nitrogenadas: A, C, T y G.

Una cadena de ADN se forma por la union de los nucleótidos en forma covalente y se realiza entre el OH del azúcar y el grupo fosfato una union fosfodiester.

Las dos cadenas se complementan entre si como imágenes espejo y se encuentran interaccionando entre ellas por enlaces pte de H que son uniones no covalentes. (C-G y A-T).

Se puede decir entonces que el ADN esta formado por dos polímeros de nucleótidos, cada uno formado por uniones covalentes de nucleótidos. Estos polímeros esta unidos entre si por uniones no covalentes enfrentándose en forma de imagen especular.

La estructura final del ADN fue conocida en 1953 por Watson y Crick, quienes diseñaron el modelo tridimensional del ADN que es aceptado actualmente.

Este modelo propone que el azúcar y el grupo fosfato están mirando hacia fuera de la estructura tridimensional de doble hélice y las bases hacia adentro de ella.

La secuencia completa de ADN en todos los cromosomas de una especie se denomina genoma. El genoma humano normal se compone por 23 pares de cromosomas: 22 pares autosomicos y un par de cromosomas sexuales (X e Y).

La parte central del cromosoma se denomina centrómero y separa los dos brazos: el corto denominado p y el largo denominado q.

Durante la gametogenesis las células diploides producen células haploides a través de dos divisiones celulares especiales en un proceso denominado meiosis. Cada célula germinal haploide que resulta de la meiosis contiene uno de cada uno de los 22 pares de cromosomas autosomicos y un cromosoma X o Y. En la fertilización se fusionan un espermatozoide y un ovocito para formar una célula diploide normal. La cigota se replica en sucesivas divisiones mitóticas, en las cuales todos los cromosomas son replicados en cada una de las células de la descendencia, por esto si una mutación esta presente en el espermatozoide o en el ovocito que dieron lugar la célula cigota, cada célula de nuevo ser contendrá esa mutación. En este fenómeno se basa la transmisión de mutaciones que predisponen a enfermedades hereditarias. Es importante comprender que un gen puede tener distintas formas o variaciones en su secuencia de ADN en los individuos de una población. Esas formas o variantes del mismo gen se llaman alelos.

En la meiosis los pares de cromosomas se separan, de modo tal que un óvulo o un espermatozoide tiene solo un alelo de cada par. Cuando las dos células germinales se fusionan, la descendencia tendrá dos copias para cada alelo. Si la descendencia hereda dos alelos del mismo tipo, se la considera homocigota para ese alelo, si en cambio, los alelos heredados son distintos se la considera heterocigota para ese alelo. Esta herencia de genes se la conoce como segregación alelica.

Duplicación del ADN

La duplicación del ADN es un proceso que se realiza antes de la división celular e involucra la polimerización de los diferentes nucleótidos.

Esta replicación se realiza por un complejo multienzimatico donde intervienen enzimas y proteínas sin actividad enzimatica.

La duplicación es un proceso en el cual una secuencia de nucleótidos del ADN es copiada, sintetizándose dos cadenas complementarias con nucleótidos con bases complementarias.

Este proceso necesita que un nucleótido no polimerizado aun, reconozca su complementario en la cadena con nucleótidos ya polimerizados. Para que ello ocurra se necesita que se separen las cadenas. Este mecanismo permite el enfrentamiento de los nucleótidos no polimerizados con sus complementarios. Este proceso permite el inicio de la polimerización.

Para comenzar la apertura de la hélice actúa una enzima llamada helicasa (topoisomerasa II), que utiliza ATP para poder actuar a lo largo de la cadena.

La hélice a pesar de estar formada por interacciones no covalentes es muy estable, es por ello que para abrir dicha hélice mediante la acción de la enzima helicasa, son necesarias además, unas proteínas llamadas "proteínas desestabilizantes" o SSB.

Estas proteínas se ubican como en caravana a lo largo de la cadena de nucleótidos de una forma muy particular, dejando libres las bases de nucleótidos para que puedan ser reconocidos por las bases de los nucleótidos que se complementaran y formaran la nueva cadena.

A medida que la hélice se desenrolla comienza a existir una presión por delante de la abertura que hace girar al ADN. Este giro requeriría gasto de energía para que no se produzca la ruptura de las hebras de ADN. Para evitar este fenómeno actúa una enzima que sigue a la abertura de la hélice denominada topoisomerasa; esta tiene como función romper y reparar las uniones fosfodiester y así evitar el giro. A esta enzima se la denomina nucleasa reversa. De esta forma se desarrolla el ADN y permite que actúe la enzima polimerizante.

La polimerización del ADN se origina en sitios llamados regiones de origen, en los cuales actuarían algunas proteínas poco caracterizadas llamadas proteínas de iniciación que indicaría el punto de origen para el comienzo de la acción de la helicasa y la polimerasa.

La polimerización se realiza por una enzima llamada ADN polimerasa que usa como sustratos a los desoxinucleotidos trifosfatos.

Cada cadena es copiada formándose cuatro cadenas, donde dos de ellas ya están previamente polimerizadas y son las llamadas cadenas molde o templados, a este proceso de duplicación se lo llama semi-conservativo.

Las cadenas de ADN están enfrentadas de manera tal que el comienzo de una cadena de polímeros tendrá un extremo 3´ del azúcar y en el otro extremo 5´. La cadena que se enfrenta y es complementaria, tendrá en el extremo 3´de la primera cadena, el extremo 5´ y en el otro extremo 5´ tendrá el 3´. En otras palabras las cadenas de polímeros van en dos direcciones una de 3´ a 5´ y la otra de 5´ a 3´. Es por ello que se las denomina antiparalelas.

La ADN polimerasa solo puede polimerizar en sentido 5´-3´. Ello representa que una cadena se puede copiar directamente pero la otra necesitara de un polímero pequeño de ADN que se denomina primer o iniciador. La ADN polimerasa usa como soporte para polimerizar los desoxinucleotidos a este primer.

Este pequeño polímero esta formado por la acción de una enzima llamada ARN polimerasa ADN dependiente.

Los desoxinucleotidos que se van a polimerizar por la acción de la ADN polimerasa, luego de la síntesis del cebo, se formarían en fragmentos. Este fenómeno fue descubierto por Okasaki, de allí que los fragmentos se denominen fragmentos de Okasaki. De manera tal que una de las cadenas estará copiada en fragmentos a los cuales se los debe unir y además eliminar los pequeños ribonucleótidos usados de cebo.

La síntesis de ADN se inicia normalmente en muchas regiones llamadas puntos de origen de replicación y los mismos se encuentran en cada cromosoma. La iniciación de esta síntesis esta controlada por la Activacion de las proteínas quinasas dependientes de ciclina. La replicación se origina en diferentes sitios pero además cada origen de iniciación se activa a diferentes tiempos en regiones del cromosoma que se organizan en el espacio en forma de clusters dentro del núcleo. La replicación se produce solo una vez por el ciclo celular, o sea que se origina de una sola copia los cromosomas y no se producen nuevos sitios de origen de replicación hasta no haber finalizado el ciclo.

En los sitios donde se generan sitios de origen, generalmente se encuentran en la secuencia del ADN regiones ricas en A/T. Existen unas secuencias llamadas ARS-binding factor (ABF-1), luego se identificaron dos complejos denominados ORC que esta formado por 6 polipéptidos y se denomina multiprotein origin recognition complex. Otra proteina descripta involucrada en los mecanismos de iniciación es la denominada replication protein A. Es una proteina que es fosforilada durante la fase S del ciclo celular por Activacion de las quinasas dependientes de ciclina.

Cual es la señal que da lugar a la interacción de este tipo de proteínas con el ADN? Aparentemente durante la mitosis se produciría la permeabilizacion de la membrana nuclear para dar lugar a la penetración en el núcleo de un factor denominado "licensing factor" necesario para que se produzca la union de los complejos proteicos con secuencias de ADN y dar lugar a la formación de nuevos y múltiples sitios de iniciación.

La enzima o los complejos enzimáticos que finalmente dan lugar a la replicación del ADN son los formados por unas enzimas llamadas ADN polimerasas. La función de estas enzimas es la de adicionar nucleótidos para formar una cadena de ADN, comenzando por un pequeño grupo de nucleótidos o base llamado primer. A su vez tienen la capacidad de reparar un error cambiando un nucleótido incorporado erróneamente.

Se han realizado estudios estructurales en dos polimerasas, una denominada Fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. Coli y la transcriptasa reversa del virus HIV-1 del SIDA.

La ADN polimerasa de Klenow normalmente usa como templado al ADN. La transcriptasa reversa puede usar ADN o ARN. Ambas enzimas tienen asociado un dominio que presenta actividad de nucleasa, pero este dominio tiene funciones diferentes en ambas enzimas. En la Klenow la región de nucleasa sirve para reparar errores en la introducción de nucleótidos. Mediante este sitio la polimerasa saca el nucleótido erróneamente agregado por la misma enzima. Es una actividad de 3´-5´exonucleasa. En el caso de la transcriptasa reversa esta actividad de nucleasa sirve para romper la union entre el ARN que usa como templado y el ADN sintetizado. También son diferentes en su estructura 4ª. La Klenow es un monómero y la transcriptasa reversa es un dimero formado por subunidades de diferente tamaño.

La estructura de la Klenow muestra que es una proteina constituida por dos dominios bien definidos. Uno largo c-terminal conteniendo una hendidura o hueco y otro mas pequeño globular en el amino-terminal. La actividad de exonucleasa esta localizada en el dominio amino-terminal, mientras que el sitio activo de polimerasa se encuentra en el dominio c-terminal. Este sitio a su vez puede ser dividido en 3 dominios denominados "palm, fingers y thumb". El subdominio palm contiene estructura de hoja beta plegada y contiene al sitio catalítico. El subdominio fingers esta compuesto por estructuras de alfa hélice y el dominio thumb contiene dos cadenas alfa hélice paralelas de gran longitud. Se han descripto además lugares de interacción o binding sites para metales divalentes en la región de exonucleasa como así también en la región catalítica de polimerasa. Los iones que interaccionan son de Mg, Mn o Zn.

La estructura de la transcriptasa reversa, la cual puede emplear ADN o ARN como templado dando híbridos de ADN-ARN o duplicados de ADN, se puede presentar como un heterodímero formado por una subunidad de 66 kDa y una de 51 kDa, encontrándose la actividad de polimerasa en la subunidad de 66 kDa. Esta transcriptasa tiene un dominio con actividad de ARNasa denominado ARNasa H y esta localizado en un dominio separado de la actividad de polimerasa y localizado en la región c-terminal.

El sitio activo de ambas polimerasas esta localizado en la región denominada palm, contiene el sitio catalítico, la región que une por el sitio 3´ terminal la cadena donde se van polimerizando los nucleótidos también denominada primer. Esta región contribuye a la union del nucleótido a ser agregado. Esta región es la mas conservada de todas las polimerasas.

La nomenclatura de las ADN polimerasas se puede encontrar indicado con letras griegas por ejemplo, ADN polimerasa a, d y e, también conocidas como polimerasas I, II y III, respectivamente. Existen otras ADN polimerasas descriptas, por ejemplo b, en levaduras, aunque su acción no seria en los procesos de replicación sino mutagenesis, haciendo by pass en los sitios damnificados del ADN.

De todas las ADN polimerasas en eucariotas, la delta es la mas conservada desde levaduras a humana. Las polimerasas también tienen actividad de exonucleasas, en el caso de la polimerasa delta ambas actividades residen en la subunidad de mayor tamaño.

La polimerasa epsilon humana también tiene dos subunidades, pero en este caso la subunidad catalítica tiene 225 kDa y la restante 50 kDa. Su función es desconocida. Esta polimerasa tiene su acción principalmente en la reparación de ADN, sin embargo, esto no descarta que a su vez actúe en los procesos de replicación. Esta polimerasa también interviene en el control de los check points en la fase S, actuando como sensor para la replicación, transmitiendo señales inhibitorias para prevenir procesos transcripcionales inapropiados durante esta fase del ciclo celular. Estas dos funciones residen en diferentes dominios de la proteina; en el amino terminal se encuentra la actividad de polimerasa y en el carboxilo terminal la función de control de check point.

La distribución de las polimerasas es asimétrica y se sabe que los errores en la replicación pueden estar inducidos por error en la distribución de las proteínas o concentración de nucleótidos en estos sitios.

En los últimos años se han descripto una serie de factores accesorios a las ADN polimerasas que pueden dividirse en tres grandes clases: a) proteínas que se unen al ADN como cadena simple; b) factores de reconocimiento entre el templado (cadena de ADN) y el iniciador o primer y c) factores de procesamiento. Dentro de estos factores se puede mencionar una proteina denominada RP-A, cuyo equivalente en levadura es RV-A. Esta compuesta 3 subunidades y es requerida tanto para la iniciación como para la elongación de la cadena de ADN. Esta proteina es fosforilada y la fosforilación en al menos una de sus subunidades tiene un papel fundamental en este proceso.

Otro factor es el llamado PCNA y su papel es esencial durante la replicación del ADN. Esta identificado como un factor auxiliar de la polimerasa delta. Este factor interacciona con una proteina denominada p21, que es un inhibidor de la proteina p53, proteina relacionada a los genes supresores y relacionadas a la cascada de las proteínas quinasas dependientes de ciclinas.

Otro factor el RFC (llamado factor de replicación C) es una proteina que une ATP y tiene actividad ATPasa, siendo esta actividad máxima cuando se produce la interacción del iniciador o primer con el templado.

Expresión de la Información Genética

La expresión de la información genética involucra la traducción de una secuencia lineal de nucleótidos de ADN en una secuencia colineal de aa.

La copia del ADN dando lugar al ARNm se denomina transcripción y la copia del ARNm en una secuencia lineal de aa se denomina traducción.

La translación de la secuencia nucleotidica de ADN en proteínas se basa en un código de triplete de nucleótidos.

Cada triplete, llamado codon, codifica para un único aa; existiendo 4 bases y expresándose como tripletes se forman 64 (4³) posibles codones para codificar solo 20 aa, o sea que para cada aa hay mas de un codon, esto se denomina código redundante.

Algunos de los codones tienen funciones especiales: AUG codifica para metionina e inicia la traducción de todas las proteínas, hay 3 codones de finalización de traducción que son UAA, UGA y UAG.

ACIDOS RIBONUCLEICOS (ARN)

La transcripción da lugar a la formación de tres tipos de ARN, mencionados el mensajero, el ribosomal y el de transferencia.

Los ARNs son de simple cadena y las bases que los constituyen son: adenina, guanina y citosina; uracilo.

Las moléculas de ARN se sintetizan en el núcleo (algunas formas se sintetizan en la mitocondria) y son exportadas al citoplasma, mientras que las proteínas que tienen función en el núcleo se sintetizan en el citoplasma y son importados al núcleo.

El núcleo esta cerrado por una envoltura que consiste en un par de membranas concéntricas. La membrana externa se continua con la membrana del RE y el espacio perinuclear, entre la membrana externa y la interna se continua el lumen del RE.

El intercambio de los materiales se realiza a través de los poros nucleares.

ARNm

El ARNm es tipo especial de ARN en el cual la secuencia nucleotidica del mismo es complementaria a una de las cadenas del ADN. Existen en el ARNm un conjunto de tripletes de nucleótidos llamado codon que provee la información especifica para reconocer un aa.

ARNt

Estos ARNs son pequeñas moléculas cuya función es la de actuar como transportadores intracelulares de los aa hacia los ribosomas como síntesis proteica. De los 20 aa que se encuentran en las proteínas, cada uno de ellos tiene por lo menos un ARNt que lo transportara específicamente. Algunos aa pueden ser transportados por mas de un ARNt.

ARNr

Al ARN ribosomal constituye cerca del 65% de la masa ribosomal. En células eucariotas existen 4 tipos de ARNr, cada uno identificado, cada uno identificado por su coeficiente de sedimentación como 5S, 7S, 18S y 28S.

transcripción

El ARNm es traducido a una proteina en una serie de reacciones catalizadas por un gran complejo llamado ribosoma.

Los aa utilizados para formar la proteina son transportados hacia el ribosoma por el ARNt que representaría el lápiz siguiendo el ejemplo grafico.

Los ARNt presentan una estructura tal que cada 3 nucleótidos del ARNm existen en el ARNt otros 3 nucleótidos que se reconocen en forma complementaria. Este reconocimiento se realiza a través de las bases de ambos ARN.

Para que se produzca la expresión de estos genes en forma especifica y diferencial existen unas unidades denominadas de y tanscripcion, que dan lugar a la formación de transcriptos específicos llamados transcriptos primarios.

La unidad de transcripción es una región del gen que contiene una señal para la generación del transcripto primario. Principalmente esta unidad de transcripción debe contener un sitio de iniciación y uno de terminación de la transcripción. El producto de esta unidad de transcripción son los ARNs que darán lugar a la síntesis proteica.

Un fragmento de ADN que servirá para que finalmente se sintetice una proteina, previa formación del ARNm, esta formada por varias regiones cada una con una función especifica a saber:

1)       Una región de control

A la misma se le atribuye la función de controlar el incremento de la transcripción. Estas secuencias de control tienen características muy interesantes como por ejemplo:

-          Están formadas por 300 a 500 pares de bases con secuencias repetitivas en su cadena con independencia funcional.

-          Pueden actuar a distancia del sitio de iniciación.

-          No necesariamente se encuentran por delante del sitio de iniciación de la transcripción.

2)       Una secuencia CAAT y una secuencia TATA

Estas dos secuencias están involucradas en la union e iniciación de la transcripción.

3)       El punto de iniciación de la transcripción

Este punto depende de la presencia de un promotor. La función que cumpliría el promotor seria señalar el punto de inicio de la transcripción.

4)       Los exones

Son secuencias de nucleótidos que darán lugar a la transcripción de los nucleótidos con bases complementarias para la formación del ARN.

5)       Los intrones

Estas secuencias se hallan intercaladas entre las secuencias codificantes. Estas secuencias también son transcriptas pero luego se pierden en la etapa de maduración del ARNm.

6)       Una secuencia AAUAAA, un punto de poliadenilacion y una señal de terminación

Inmediatamente terminada la transcripción una enzima denominada poliA-polimerasa efectúa un corte y poliadenilacion del extremo 3´, usando ATP como sustrato. Esta enzima agrega entre 100 y 200 residuos de ácido adenilico. Esta adición esta dirigida desde el lugar donde se halla la secuencia AAUAAA. La eliminación o mutación de esta secuencia evita la poliadenilacion. La poliadenilacion se realiza antes de que el ARN salga del núcleo.

Todavía no se conocen los mecanismos de terminación de la transcripción o cuales serian las secuencias que determinan que la enzima encargada de la síntesis de ARN (polimerasa) se desacople de la unidad de transcripción.

En las células de organismos eucariotas se han encontrado 3 tipos diferentes de polimerasas. Cada una de estas polimerasas son enzimas encargadas de sintetizar un tipo de ARN. La polimerasa llamada de tipo I es la encargada de catalizar la transcripción del ARNr. Se encuentra en el nucleolo y es la encargada de producir alrededor del 50 al 70% de la transcripción nucleolar total.

La polimerasa tipo II que se halla en gran parte asociada a la cromatina es la responsable de la formación del ARN precursor del mensajero. Este ARN precursor también se denomina heterogéneo. El tercer tipo de polimerasa tipo III es la encargada de sintetizar ARN pequeños incluyendo la fracción 5S del ribosoma.

En el proceso de transcripción para que se produzca la síntesis de ARN por apareamiento de nucleótidos por intermedio de sus bases, en primer termino se deben separar las cadenas de ADN. Ello sucede en el punto de union de la ARN polimerasa y requiere la presencia de una secuencia determinada de nucleótidos que como describimos anteriormente se denomina promotor. Luego se produce la elongación de la cadena de ribonucleótidos, donde los mismos son adicionados por acción de la polimerasa, formándose uniones covalentes adicionándose a partir de la cadena por el extremo 3´avanzando la polimerasa en sentido 3´-5´. Por delante de la polimerasa las hebras de ADN se van desenrollando y por detrás de la polimerasa se van enrollando. Cuando la polimerasa reconoce el sitio de union de terminación se agrega el ultimo ribonucleótido y el transcripto se desacopla liberándose la polimerasa y volviendo el ADN a su configuración original de doble cadena en forma helicoidal.

Cuando se conocieron los mecanismo de transcripción y traducción se planteo la interrogante de cual fue la primer molécula existente el ARN o el ADN, dado que para el inicio de la síntesis de proteínas se necesitan enzimas y las enzimas son proteínas.

En experimentos muy recientes se ha comprobado que el ARN puede presentar actividad enzimatica, sobre todo para la formación de los enlaces entre aa. De ahí que se haya elaborado la siguiente hipótesis para la explicación de la aparición de los organismos.

Se postila que aparentemente se sucedieran una serie de eventos que, en la secuencia del tiempo, se pueden exponer en 4 etapas:

1)       Formación de polímeros de ARN capaz de dirigir su propia replicación.

2)       Desarrollo del mecanismo por el cual el ARN de lugar a la síntesis proteica.

3)       Formación de una membrana lipidica que contenga a la mezcla de ARN y proteínas.

4)       Desarrollo del mecanismo por el cual se forme el ADN capaz de conservar la información que transmitía el ARN y de esta manera conservar la información y la especie ante cualquier destrucción de los ARNs.

Resulta fundamental para el entendimiento del funcionamiento de un organismo tener el conocimiento de los elementos que dan lugar a la duplicación del ADN, a la transcripción con formación del transcripto primario y se realiza antes de que los mismos abandonen el núcleo. El primer proceso es la adición en el extremo naciente de un 7-metilguanilato. Esta adición se realiza con una union 5´-5´trifosfato.

A este proceso se los denomina adición de la caperuza o camping.

El segundo proceso es el de poliadenilacion y extracción de las secuencias no codificadas transcriptas por los intrones. A este proceso se lo denomina "de corte y empalme o splicing".

El mecanismo de corte y empalme en el ARNr lo realiza el propio ARN. En este proceso no intervienen enzimas y se conoce que el propio ARN tiene la capacidad de realizarlo sin gasto de energía con ganancias y perdidas de uniones fosfodiester.

El ARNt también sufre el proceso de corte y empalme, pero a diferencia del ribosomal, este proceso se realiza por acción de una endonucleasa. Esta enzima realiza dos cortes en el extremo de intron transcripto para luego actuar una ligasa y unir los dos extremos.

El ARNm es acortado en forma diferente y por un proceso que involucra a ribonucleoproteinas. Estas se unen por complementariedad de bases a secuencias conservadas entre los nucleótidos transcriptos por intrones y exones. Como paso intermedio en esta reacción se forma una estructura en forma de lazo en la cual el extremo 5´ se pliega sobre si mismo cerca del extremo 3´. Estas secuencias que se localizan en los puntos de corte serian las principales determinantes de los puntos de corte y empalme. Se denominan secuencias consensuales y son las secuencias que se conservaran en la mayoria de los genes. La mutación de una de estas secuencias llevara a la síntesis proteica anormal.

Uno se podría preguntar porque se transcriben los intrones si luego en el proceso de maduración se cortan y solo se empalman los exones. Pues bien, no todos los intrones transcriptos se cortan y algunos siguen en el ARN, siendo reconocido que la función de los mismos seria regular el pasaje de los ARN del núcleo al citoplasma. Otra función importante de los intrones es aparentemente la de delimitar o estar entre las uniones de exones que darán lugar a la síntesis de dominios funcionantes en las proteínas.

Este proceso de corte y empalme tiene una función biológica muy interesante que se ha observado en la síntesis de IG. De un mismo transcripto se pueden empalmar exones transcriptos no necesariamente contiguos. Esto trae como consecuencia que de una sola transcripción se puedan sintetizar proteínas diferentes con funciones diferentes. A este mecanismo se lo denomina "empalme alternativo" (splice alternativo).

Luego de la maduración del ARNm que abandona el núcleo representa entre el 1 y 2% de las secuencias presentes en el ADN.

La regulación de la transcripción esta dada tanto al inicio como al final del proceso.

Nosotros conocemos que una correcta expresión de genes, en un tiempo correcto, es el evento que dará identidad a cada célula. Como mencionamos anteriormente, existe una secuencia de ADN denominada promotor que determinara el sitio exacto de inicio de la transcripción para un gen determinado y además, también los niveles de ARN. El core de los elementos que componen el sitio promotor contiene la TATA BOX y los elementos iniciadores. Ellos se encuentran cercanos e inmediatamente después hacia la región 5´ del punto de inicio o sitio de iniciación de la síntesis de ARN. Casi todos los genes tienen un nivel mínimo de transcripción que esta dado por una maquinaria mínima de transcripción. Además la región promotora contiene sitios de reconocimiento para factores de transcripción. Estas son secuencias especificas en el ADN que unen proteínas. Estos sitios pueden activar (enhancer) o reprimir (represor) la transcripción.

Los activadores desde el punto de vista funcional, parecen ser proteínas que interaccionan con el ADN por sus dominios ácidos, ejemplificados por residuos ricos en glutamina o prolina. Los represores son menos conocidos desde este punto de vista, pero parece que principalmente se encuentran en los dominios ricos en alanina.

La base de acción de estos activadores y represores, es la interacción proteina-proteina y su consiguiente interacción con secuencias especificas en el ADN.

Dentro de los factores de transcripción para la mayoría de los promotores, los primeros identificados fueron los denominados TFII, conociéndose 8 de ellos denominados: TFII A, B, C, D, E, F, G y H. Estos factores actúan en la iniciación de la transcripción generado por la acción de la ARN polimerasa II. Estos factores se unen en la región del promotor conocido por secuencias ricas en A y T, llamada TATA box y guardan una secuencia temporal de union, siendo aparentemente el TFIID el primero en interaccionar con la región TATA, luego interaccionaría el TIFA, TFIIB y TFIIF.

La TATA box o los elementos iniciadores también son reconocidos por un componente del TFIID denominado proteina de union de la TATA box (TBP). Esta proteina actúa con la ARN polimerasa I y II. La TBP es un componente integral de la maquinaria de transcripción.

Existe un grupo de proteínas que actúan junto al TBP y se denomina TAF. Se postula que los activadores se unen secuencialmente en el tiempo para activar la transcripción vía la interacción con el TBP y los factores asociados a TBPs o TAFs.

Existen otros factores llamados adaptadores, que conceptualmente no difieren de los TAFs y actuarían sin necesidad de reconocer el ADN, pero si al TBP como parte de los mecanismos de Activacion de la transcripción. Dentro de estos  adaptadores existe una proteina llamada CBP que se une a un factor de transcripción CREB y es denominada CREB-binding protein. El primer CREB-binding protein factor caracterizado fue el CREB pero luego se han caracterizado por lo menos diez factores mas, comprobándose que estos factores pertenecen a una familia de genes con características similares. Son los siguientes: todos ellos pertenecen a la clase de factores de transcripción denominados bZIP, característicos por tener entre 4 a 6 leucinas. En algunos, la histidina puede reemplazar a la leucina. Estos factores pueden heterodimizarse, pueden sufrir cambios por splicing y pueden actuar como activadores o represores. Estos factores contienen sitios de fosforilación para PK A, C y quinasa de caseína. Estos sitios una vez fosforilados pueden regular la actividad de CREB. Estos factores pueden ser regulados a través de la Activacion de PKA dependiente de AMPc.

Otra familia de factores es la denominada CREM, que tiene un papel muy importante en la rta nuclear al AMPc y tiene mucha importancia en la fisiología neuroendocrina.

Después de la transcripción de ADN en ARN, este ultimo es procesado antes de salir del núcleo. En este proceso las regiones que no codifican (los intrones) desaparecen. De esta forma solamente la información contenida en los codones de los exones es usada para formar la secuencia aminoacidica. Después que los intrones son eliminados continua el proceso de maduración del ARN pasa la citoplasma para ser traducido en proteina.